简介
NIPT (新型产前诊断)是指「从母亲的血液中检查胎儿染色体异常,如21号染色体三体综合症 (唐氏综合症)、18号染色体三体 (爱德华兹综合症)、13号染色体三体 (帕托综合症)」 的检查。与传统的血液产前诊断相比，从灵敏度和特异性来看，测试本身的准确性非常高。孕妇的血液中存在来自婴儿的DNA片段。NIPT可以通过分析来自婴儿的DNA片段来检查婴儿在出生前是否存在这些染色体异常的可能性。
NIPT的优点是，不像羊水或绒毛检查需要在子宫内扎针,因为NIPT是通过从母亲的手臂抽取血液进行的产前诊断,不仅对母亲的侵袭性 (对身体的伤害) 低,而且这些检查也没有流产的风险 (0.3%~1%) 。此外，由于NIPT检查的准确性很高，因此NIPT可以作为可靠的指标,以帮助医生根据检查结果确定潜在的疾病风险。
但是，作为NIPT的注意事项，应了解NIPT是一种筛查测试,而不是可提供明确答案的确定性检查。归根结底是作为概率调查胎儿患染色体疾病的风险是高还是低。因此，在进行NIPT检查之前，建议在与医生充分讨论NIPT可能发现的染色体疾病、NIPT原理、检查机制、优点和注意事项后再进行检查。
在本文中，根据NIPT的原理,将介绍在进行NIPT检查时如何检查从母亲处采集的血液并获得分析结果以及NIPT的注意事项。
NIPT (新型产前诊断) 的原理
根据NIPT (新型产前诊断)的原理,从孕妇的血液中提取胎儿的DNA片段,并通过机器 (测序仪) 详细分析DNA片段来检查胎儿是否患有染色体疾病,如21号染色体三体综合症、18号染色体三体综合症和13号染色体三体综合症。NIPT检查的对象是孕妇血液中的胎儿的DNA,因为需要分析来自胎儿而不是母体的DNA,以确定胎儿而不是孕妇是否有染色体异常,并检查胎儿是否患有这些染色体疾病。在本项目中，将介绍NIPT检查所需的DNA,测序器和分析方法。
NIPT (新型产前诊断) 所需的DNA
传统的产前诊断是通过收集含有胎儿DNA的羊水或绒毛并检查胎儿DNA序列来确定染色体疾病。
另一方面，NIPT (新型产前诊断)则利用存在于母体血液中的胎儿DNA。DNA最初以染色体的形式存在,存储在体内的1个细胞 (cell) 的细胞核中,但已知DNA片段也会流入血液中,这也被称为cell free DNA (cfDNA) 。NIPT检查使用这种cfDNA,但cfDNA不仅用于NIPT,还用于癌症和其他疾病的检查，从cfDNA采集到确定的流程是可靠和安全的。这被认为是具有高度安全性的检查技术之一。
用于NIPT检查的cfDNA源于胎盘中的胎儿的血液並通过母体血液流出,检查机构提取cfDNA并分析DNA序列,然后根据结果,医生在胎儿出生前确定胎儿是否患有染色体疾病。
测序仪
测序仪是一种读取DNA排列 (序列) 的机器,目前有一种被称为新生代测序仪NGS (New Generation Sequencing) 的最新产品。测序仪在1970年代使用了一种被称为Sanger方法的技术,即使成为了NGS,基本机制也不会改变,其目的是读取所提取的DNA的碱基序列。
生物的DNA由A (腺嘌呤) 、T (胸腺嘧啶) 、G (鸟嘌呤) 、C (胞嘧啶) 4种碱基排列而成，而且碱基基本上是成对的, A和T、G和C成对 (互补性) ,以2根DNA结合的形式 (双链DNA) 存在。通过折叠这些物质,形成称为染色体的结构,并将其存储在称为细胞核的每个细胞中。DNA中存在具有特定共同碱基序列的位点，通过读取该序列是否正常 (基因测序) 来发现基因异常。
作为测序仪的具体方法，首先从样本中提取和纯化目标DNA,使其成为单个DNA状态。然后，具有特定碱基序列被称为引物的试剂以配对的方式连接到目标DNA中存在的碱基序列的末端。之后，将被称为ddNTP的A、T、G、C分别添加了由不同颜色的荧光的碱基混合而成的试剂,与被称为DNA聚合酶配对的各碱基连接并延伸的试剂相互配合,将1个碱基逐一添加到单个DNA上,从而读取原来提取的DNA的基因序列。
然而，使用传统测序器进行测序主要有2个问题。一个是每次测序只能读取一个DNA,并且为了找到多个基因异常,有必要提取和测序多个DNA,这需要花费大量时间和精力。其次,传统的测序需要大量的DNA,也就是说在DNA提取的阶段需要大量的样本,因此为了读取像cfDNA这样本来存在量就很少的DNA,就需要提取相当数量的血液和组织,这使得侵入性很高并且困难。
因此， NGS就是为了解决这些问题而新开发出来的。对于上面提到的第1个问题, NGS在测试过程中创建了一个名为DNA数据库的DNA目录,并可以在一次测序中以数百万到数十亿个单位的水平一次性读取DNA碱基序列。换句话说，现在执行一次可以与执行数百万次传统测序相同的水平。针对第二个问题,已经开发出更有效和更多地提取DNA的试剂和方法,但在NGS的情况下,即使DNA的量很少,也可以读取碱基序列。即使DNA的原始存在量较少,例如cfDNA,也可以发现基因异常。
分析方法
作为胚胎来源的cfDNA的分析方法,以前也有用于其他基因分析的SNP分析 (single nucleotide polymorphism:也称为单核苷酸多态性,用于检查1个碱基是否不同 (例如:正常情况下为A的地方为T) ) ,微阵列分析 (多个DNA序列排列在芯片 (基板) 上,通过结合从想要检查的样本中获得的DNA来检测DNA量的方法) 等,但被称为MPS法 (massively parallel sequencing) 的分析方法被认为是标准的。
MPS法是利用来自胎儿的cfDNA进行NGS的分析,并结合来自各染色体的成分量的分析来进行的。也就是说，在得到的胎儿来源的cfDNA中，可以定量地调查是来自哪个染色体。例如，如果胎儿很可能是21号染色体三体综合症，则21号染色体比正常的2条染色体多了1条,也就是说,来自21号染色体的DNA数量也增加了1.5倍 (3÷2=1.5) 。
但是，不仅是NIPT的检查,用于确认其他基因疾病的基因检查也是一样,无论采用哪种分析方法,都还未能得到100%的确切证明,说到底还是应该认为只是筛查检查。
NIPT (新型产前诊断) 的检查机制
作为NIPT (新型产前诊断)的机制,大致流程如下。
从孕妇身上抽血→提取胎儿来源的cfDNA→制备基因库→分析cfDNA序列→判断染色体异常的可能性
从母亲身上抽血
具体而言，在怀孕第10周0天后,从孕妇的手臂采集10~20mL (约2小匙至1大匙) 血液,以提取漂浮于血液中的胎儿cfDNA。当然，此时也包含来自母体的cfDNA,因此有必要留意这一点,并在后面进行说明。
为什么需要抽血
因为从母亲处抽取血液比其他方法,如收集羊水和绒毛,具有更低的侵入性。
如果直接提取胎儿DNA的组织或细胞,可获得最准确的检测结果,但直接提取对胎儿的风险非常大,可能会导致孕妇和胎儿的流产风险。因此，通过收集母体血液中的胎儿cfDNA,可以在不影响胎儿的情况下进行产前诊断。
母体血液的离心分离
为了从母亲血液中提取来自胎儿的cfDNA,将母体用一种叫做离心分离机的设备分离成各个成分。
我们人类的血液基本上分为两部分，液体成分 (血浆:约55%) 和其他成分，如细胞或蛋白质，这些成分在整个身体中相互混合。因此，通过将从血管中收集的血液离心分离,将其分离为血浆, Bafe涂层 (显示为含有血细胞的薄层) 和红血球的各个层。举例来说,如果你把水和油放在同一个容器里,水和油就不会混合,所以比水更重的油会下沉。这种技术通常用于医院和健康检查中的血液检查。
由于血浆中含有来自胎儿的cfDNA,而来自母体的血液成分中的白血球浓厚液和红血球,为了准确地进行NIPT检查,在准备检查的阶段,需要仔细地只提取血浆。
分析的结果
结果的分析首先收集母体血浆中的所有DNA片段,并制备具有特殊标记的基因库。用NGS对该基因库进行测序 (MPS方法) ，并在分析步骤中鉴定每个DNA片段来源于多少号染色体。
将从DNA片段中得到的遗传信息在参考序列上进行排序,将相应部位的遗传信息多寡与临界值 (判断21号、18号、13号染色体的正常和异常的基准值) 进行比较,确定阳性、阴性或判定保留。
Hiro诊所NIPT的检查根据方案而有所不同,但结果将会在2〜6天内公布。
以下是这些步骤的逐步介绍。
测序
如上所述， NIPT检查使用NGS对来自胎儿的cfDNA进行测序。由于母体血液中也含有来自母体的cfDNA (有一种说法认为,在怀孕第10周左右的母体血液中,约10%左右是来自胎儿的cfDNA) ,因此可以将来自母体的cfDNA和来自胎儿的cfDNA一起进行全面测序。
具体来说，首先在诊所观看NIPT的解说视频、填写问诊表和同意书、由医生进行诊察和抽血。然后在诊所或认证机构通过分离法获得母亲的血浆,然后从母亲的血浆中提取cfDNA并通过NGS进行全面测序。
鉴别
在进行全面测序 (MPS方法) 后，我们将继续进行鉴定的步骤。如分析方法项目中所述，通过定量测量来自胎儿的cfDNA来自哪条染色体,可以检测21、18、13号染色体三体或性染色体 (生物学上,男性有X染色体和Y染色体,女性则有两条X染色体) 的异常。此外,还可以进行性别判断。
判定
关于NIPT的判断，如识别中的项目部分所示,通过定量测量进行判断。由于DNA不是肉眼可见的,因此需要量化数据和明确的标准。
具体而言，通过将来自NGS的数据与临界值进行比较来判断。临界值简而言之就是基准值。通过确定特定数值作为参考值，可以确定结果中出现的数值距离该数值有多远。
例如，当健康检查报告结果时,「标准值」 记录为范围,如果超出范围,则判断为 「待检查」 。同样， NIPT检查也设定基准值 (临界值) ,与此对照进行判定。
NIPT (新型产前诊断) 的注意事项
NIPT (新型产前诊断)是一种非确定性的检查,用于在产前确定胎儿是否染色体异常,并判断异常的概率是高还是低 (包括母体血清标志物) 。因此，根据NIPT的结果，如果判定自己的胎儿有染色体异常的可能性高的话，进行确定性诊断是很重要的。明确诊断需要进行确定型检查 (如羊水检查和绒毛检查) 。以下是其他NIPT的注意事项。
胎盘嵌合体 (CPM)
需要注意的是， NIPT所使用的母体血浆中含有的胎儿cfDNA大部分源自胎盘,因此并不是只检测胎儿的cfDNA。因此，当胎儿和胎盘的染色体核型不同 (称为胎盘嵌合体 (CPM) ) 时,检查结果无法正确反映胎儿的染色体信息。
消失的双胞胎
初始阶段以双胞胎 (twins) 形式受孕,在怀孕早期,其中一个胎儿死亡,并在子宫内被吸收,这一现象被称为消失的双胞胎。是在子宫内通过超声波检查等也看不到的状态 (消失) 。即使在这种情况下，也存在检测出死亡胎儿的DNA等影响NIPT结果的可能性。
判定结果为 「假阳性」 「假阴性」 「再次检查 (待判定) 」 时
基本上，检测结果报告为「阳性」 或是 「阴性」 ,但也不能完全排除是 「假阳性」 、 「假阴性」 或是 「重新检查 (待判定) 」 的可能性。
「假阳性」 是指胎儿实际上是健康的却被判定为阳性, 「假阴性」 是指胎儿实际上有染色体异常却被判定为阴性。
这些报告结果的原因有很多,但大致分为母亲或胎儿的生物学原因,以及上述胎盘嵌合体 (CPM) 。如果母体或胎儿存在生物因素,可能包括消失的双胞胎的影响、母体隐性染色体异常 (无症状) 和母体临床症状的影响 (如存在肿瘤、药物、自体免疫疾病、器官或骨髓移植) 。除此之外，还可以列举由于检查的界限导致的误差等。
目前，从国内研究结果来看，这些结果的比例估计约为0.1%~0.3%。
总结
NIPT (新型产前诊断) 是一种产前诊断,可在怀孕早期进行,是简单、微创和准确性高的检查。另外，由于采用了最先进的技术，今后还有望更进一步提高精度，能够以更少的检样量进行检查等进一步的改善。
对于父母来说，对于即将出生的孩子是否有染色体异常,为了消除其不安,可以认为是有价值的检查。但是， NIPT仅定位于非确定性检查 (筛选检查) ，需要考虑根据结果进行侵入性强的确定性检查，并且需要注意一些事项。因此，是否接受检查要在与医生和心理咨询师等医疗人员充分商量后决定,是非常重要的。
【参考文献】
- 厚生劳动省 – NIPT: noninvasive prenatal testing 无创产前遗传学检查
- ACOG – Non-Invasive Prenatal Testing
- ACOG – Current ACOG Guidance
- ACOG – Prenatal Genetic Screening Tests
- 日本医学会 – NIPT等有关产前检查的信息提供及设施 (医疗机构・检查分析机构) 认证的方针
- 日本医学会 – 非侵入性产前遗传学检查 手册
- 日本医学会 – 非侵入性产前遗传学检查
- J-STAGE – 胎儿生理学 日临麻会刊 Vol.38 No.4, 538 〜 541, 2018
- 兵库医科大学医院妇产科 – 产前诊断指南
- ACOG – 从NIPT的基础到未来的展望
- Illumina – NGS和珊格序列的区别
- Illumina –Targeted next-generation sequencing versus qPCR and Sanger sequencing
- Thermo Fisher Scientific – 什么是微阵列?|使用微阵列进行表达分析的原理和分析方法
Q&A
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Q厚生劳动省推荐哪种产前诊断方式？卫生、劳动和福利部（MHLW）认可超声波、母体血清标志物检测（Quattro 检测）和 NIPT（新型产前诊断）等非确诊检测，以及绒毛造影和羊水检测等确诊检测。如果非确诊检查结果呈阳性，建议进行确诊检查。
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Q是否应始终进行产前检查？并非所有孕妇都需要进行产前诊断。重要的是要根据孕妇的具体情况和意愿，在咨询医生后再做考虑。尤其值得考虑的是高龄孕妇和家族史。
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Q新产前诊断（NIPT）的原则是什么？NIPT 是一种分析母体血液中胎儿 DNA 片段（cfDNA）的方法，用于检测胎儿是否存在染色体异常，如 21 三体综合征、18 三体综合征或 13 三体综合征。作为一种高度准确的非侵入性检测方法，它被广泛使用。
