Riefe Perhae=Christiaens、Hans-Georg Klein编著的 『非侵入性产前基因学检测（NIPT）（副标题：基因组学在产前检测和诊断中的应用）』（Academix・Press、2018年）的第2章论文的翻译（Hiro诊所NIPT临时翻译）
第2章 在NIPT的框架下了解「新一代测序」的基本原理
南旧金山大学 Dale・Musey
介绍：测序技术的演变
「新一代测序」（NGS）一词，引发了关于「第一代测序」是什么样子，以及NGS与第一代有什么相似和不同等问题。桑格在1970年代开发了第一代DNA测序技术（参考文献1，2）。使他名声大噪的测序方法涉及在体外使用细胞繁殖器，成功地扩展了无法扩展的DNA碱基。这样变更后加入的碱基，在某些物质参与最少的反应条件下，以低浓度添加。具体而言，(1)高浓度的，可延伸碱基，(2)单链DNA，然后进行测序，(3)作为DNA模板补充的短寡核苷酸引物（新碱基可在模板上合成），以及(4)4种类型的DNA聚合酶，不同地分布延伸反应。在桑格的早期测序实验中，这4种类型的反应分别以单一的、不可延伸的碱基（A（腺嘌呤）、T（胸腺嘧啶）、G（鸟嘌呤）或C（胞嘧啶））。每当聚合酶导致其中一个不可延伸的碱基在发生阶段随机合成为DNA分子时（例如，当发生阶段的不可延伸的G与另一侧的DNA模板中的C合成时）它就会试图停止进一步的合成，因此会再生出一个没有颈部的模板。这里极其重要的是，由于发育阶段的所有链都是静止的，并从同一个寡核苷酸引物中扩增，扩增阶段停止，因此发生阶段的DNA链的长度，该分子的3’末端的基盘直接变为代理变数。这4种每一种反应，使用用于停止合成分子长度的电泳凝胶来进行分析，来推断出整个模板的序列成为可能。
桑格的测序，在引入具有独特色素并导入不能扩张的基盘中，使测序的可扩展性略有提高（图1）。与其说是通过划分4个反应来获得碱基特异性信息，不如说是通过使用毛细管电泳与荧光色素检测器相结合，来提供DNA片段的相对大小和停止扩张的基盘的正体这两种方式进行分析（文献3～5）。以不能测量为理由来批判这个仪器的人，不能忽略了它们所取得的一个不小的成就。换言之，这些仪器推动了1990年代早期人类基因组测序的发展（文献6～9）。也就是说，考虑到数十亿美元的成本和多年的时间框架，如果没有重大的技术突破，基因组测序可能在临床环境中，基本上无法使用的。
尽管新一代测序（NGS）与桑格式相比克服了许多技术的界限，使基因组测序发生了革命性的变化（文献10），但NGS最知名的方法仍然主要包括那些与过去技术共享的方法。正如后面将详细讨论的那样，新一代测序也会影响到停止扩张和荧光碱基，那时DNA聚合酶在单一基盘发生阶段的DNA分子将一时间依赖于附着技能上。事实上，在许多方面，新一代测序实验类似于在数百万或数十亿的水平上平行进行桑格式反应（这就是为什么新一代测序有另一个名字「巨型同时并行阵列」）。
新一代测序的作用
新一代测序设备的作用，是将专门制作的DNA分子库提炼成一个长文本文件序列。该文本文件，对每个被测序的分子都是单行。使用新一代测序仪，将分子映射到文本文件的范围，包括使用Broccoli进行RNA测序（文献11），到核糖体分析（一种加入核糖体的mRNA片段的深度测序方法。文献12），以及孕妇NIPT检测中的DNA测序（文献13），已经在一系列研究和临床环境中展开。新一代测序的这些应用，也被称为「文库制备」，主要是由将DNA的上游注入测序仪的方法类型来划分的。对照上游部门的各种准备分工，可以对下游部门的实际例子进行广泛的比较分析，其中之一是NIPT中使用的分析方法，这将在第3章中详细讨论。本章中，除了说明用于新一代测序的每种仪器的DNA测序方法外，针对NIPT，还探讨了从上游到下游部门存在哪些测序项目。
上游部门的测序器
DNA提取
无细胞DNA，顾名思义，不存在于血细胞中，必须从血浆中提取。无细胞的DNA碎片是死亡细胞的残留物（文献14）。当一个细胞发生程序性死亡（这被称为「细胞凋亡」。），会与一组酶结合，从而消化基因组 DNA（文献15）。这些酶只能接触到没有被困在核糖体中的DNA。核糖体由组蛋白8聚体组成，控制细胞内的基因表达和基因组拓扑结构（文献17）。核糖体DNA的不可及性意味着在核糖体内循环的少于150个核苷酸的DNA片段在细胞凋亡过程中是可行的，而从垂死细胞中逃脱的DNA片段形成无细胞的DNA，可以被测序和新一代测序读取（读取片段。测序反应的出力：梅泽）指的是测序反应的出力的意思。
为了从血浆中提取无细胞的DNA，必须首先将血液离心分离成血浆、血沉棕黄层（包含血液中的白细胞），和红细胞。约血液总量的55%。当从离心机中取出血浆时，应小心翼翼地去除沉棕黄层。这是因为如果白细胞中的母体DNA浓度过高，从胎盘中提取的稀有无细胞DNA将被稀释，削弱或完全消除检测胎儿非整倍体的敏感性。
基于商业的、标准的DNA提取技术可以用来清洗从血浆样品中提取的足够数量的无细胞DNA，以进行分析（文献18、19）。通常情况下，血浆中浓缩的无细胞DNA量仅为每１ml５~50ng，但血浆中这种低量的无细胞DNA是值得注意的，因为它是基于无细胞DNA的产前诊断所需血量下限的依据。如果血量太少，提取的DNA数量不足，由于提取的标本中基因组的拷贝数很低，可能无法检测到胎儿基因内容的轻微变化。例如，如果在提取的标本中有10个基因组拷贝，那么基因21号的数量有2%的变化就不可能被检测出来。反之，高效的提取方法将能检索到足够的基因组当量，以检测胎儿染色体畸变，即使胎儿基因组片段的数量较少。通过DNA提取要检索的基因组当量的数量，取决于随后要进行的NIPT测试。在全染色体测序（WGS）的情况下，因为血液中任何部分所需的无细胞DNA数量都很低，从病人身上提取的血液量很低就足够了（文献13）。因此，有可能尝试从一个血样中，多次提取DNA。相比之下，单核苷酸多态型法（SNP）等高知名度的技术需要每个特定区域有数百个基因组当量，据此可以高精度地测量等位基因的平衡（WGS和SNP将在第3章详细讨论）（文献20）。由于这个原因，NPIT检测SNPs所需的血量通常比WGS要高。
由于无细胞DNA的浓度很低，要测量是否有足够的无细胞DNA被提取来进行NIPT并不是一件小事。通常在进行新一代测序之前，通常可以通过PCR（？）增加提取的DNA数量。这意味着即使提取效率不高，也有可能产生大量的DNA用于测序。这意味着，提取是否低效，并不能反映出新一代测序的深度。幸运的是，要测序的数据的「复杂性」，可以让我们深入了解提取是否效率低下。例如，在WGS的情况下，有效的提取将导致基因组上有0或1个（主要是0）序列的DNA片段。这是因为测序是来自原始库的泊松样本，其中有丰富的基因组信息整合材料（文献21）。然而，除了提取效率低下外，如果原始的基因组信息整合材料库很薄，DNA片段将以小于0或1的概率被放置在染色体上，导致数据的复杂性很低。相反，如果提取效率极高，，测序所必需的足够的DNA，可能不需要PCR来产生。在这种「没有PCR」的文库制备中，文库的复杂性可能会很高。为了使胎儿非整倍体的数据有统计学意义，用数据观察新一代测序的复杂性是非常重要的。
资料库的准备工作
NGS（新一代测序）的机器
结论
NGS（新一代测序）特别适合作为NIPT的应用，首先是因为检测很细致，另一个是还没有明确察觉到的理由这2个，NGS提供了数字的核苷酸水平数据，使基于深度和等位基因的NIPT工作流程变得可行。NIPT工作流程包括，定位和量化游离DNA片段（在第3章中详细说明）。至关重要的是，NGS中使用的仪器，可以轻松快速地生成此类数据，帮助NIPT克服检查机构、受检者和患者的限制。
另一方面，由于不太为人知的原因，NGS还捕获过与胎盘来源的游离DNA相关的信号。例如，NGS测量一对片段的长度，但胎盘来源的片段一般比母体来源的片段短。此外，胎盘来源的片段以DNA甲基化为特征，随后在应用亚硫酸氢时可通过NGS检测到（文献36：甲基化的c-碱基保持不变，但未甲基化的c-碱基在亚硫酸氢作用下转化为尿嘧啶（其序列与胸腺嘧啶碱的序列相似）。）最后，NGS在单核苷酸测定过程中，确认并报告了无细胞DNA片段末端的位置，这种末端信息包含重要的胎盘信号。这是因为在确定无细胞DNA片段末端的位置时，母体和胎盘核糖体的结构不同（文献37）。通过提取和放大这些胎盘信号的分析算法，敏感地捕获胎儿染色体畸变成为可能。
基于无细胞DNA的NIPT检测，现在正迅速成为产前临床诊断的首选方法。这主要是由于NGS作为读取和计算无细胞DNA状态的手段已经成熟。当NIPT在临床实践中被如此广泛地采用时，它刺激了节省成本的技术的发展，并产生了大量的数据，从而能发现更微妙的、胎盘特有的信号。因此，量化和理论化无细胞DNA的运动，将继续稳定而迅速地发展，这种改进将改善基于无细胞DNA的NIPT的结果，并使其更广泛地被更多人使用。
翻译：梅泽真一
