NIPT检测42910名临床表现不同的孕妇 (单胎) 的非整倍性和全常染色体区域部分缺失/重复疾病的队列研究

＃摘要

背景: 自从在母体血浆中发现无细胞DNA (cfDNA) 以来，开辟了一种新型的无创产前检查方法。随着全基因组测序的进展， NIPT发现了全常染色体全域部分缺失和重复疾病。本研究旨在回顾NIPT作为非整倍性和CNV (copy number variation,计数变异) 筛查测试在42,910例单次怀孕中的有效性。

方法: 共募集了42910例具有不同临床特征的单次怀孕。直接对无细胞胎儿DNA进行测序。分析每个染色体非整倍性和全常染色体区域部分缺失・重复疾病。

结果: 共有534例怀孕 (1.24%) 为NIPT发现的异常结果,403例怀孕为产前诊断。21号染色体三体综合症 (T 21) 、18号染色体三体综合症 (T 18) 、13号染色体三体综合症 (T 13) 、性染色体非整倍性 (SCA) 及其他的染色体非整倍性的阳性预测值 (PPV) 分别为79.23%、54.84%、13.79%、33.04%及9.38%。CNV的PPV为28.99%。CNV≤5 Mb的PPV为20.83%， 5~10 Mb为50.00%，>10 Mb为27.27%.。根据怀孕特征, NIPT的PPV也不同。

结论: 作者的数据可能对于证明NIPT分析对CNV以及常见的全染色体非整倍性的有效性具有重要意义。然而，这种最新的方法仍处于CNV的早期阶段。在临床实践中，具有准确检出率和假阳性率的临床验证研究仍然是必要的。

关键字:无创产前检查 (NIPT) ，染色体非整倍性，全常染色体部分缺失・重复疾病 (MMS) ，临床特征，阳性预测值 (PPV)

上述论文的考察

根据Chen等人于2019年发表的论文,21号染色体三体综合症的发生率为155/42910=1/276,18号染色体三体综合症的发生率为44/42910=1/975,13号染色体三体综合症的发生率为33/42910=1/1300。与通常称为O组的检查项目一致。此外，这是NIPT协会在日本进行检查的检查内容。而性染色体的发生率为147/42910=1/291,仅次于21号染色体。如果是本检查,这是在O+组或A组中检测出的内容。也有智力不足等发育迟缓的情况,虽然没有进行检查,但属于频率比较多的一类。另外，包括在我国进行的D+组合中的全染色体、全常染色体全区域部分缺失、重复疾病的发生率为 (47+109) /42910=1/275,与21号染色体三体综合症相同。到目前为止，仅在1.4、5、15、22号这一特定区域检测全常染色体全区域部分缺失疾病的D组几乎没有发生，但有报告显示，全常染色体全区域部分缺失、重复疾病的发生频率较高。但是，像全染色体的非整倍性和13号染色体那样，虽然发生频率很低，但阳性预测值相对较低。可以认为，如果NIPT定位为筛选检查，也有不可避免的地方。另外，总体上给人的印象是阳性数比我国的设施少。这是因为在本论文中提取的人群中35岁以上的孕妇比例为25.03%，低于Hiro诊所。在Hiro诊所NIPT中有数量更多的感觉,但上述阳性频率的比例在感觉上接近。

简介

自1997年 [1] 在三端血浆中发现无细胞胎儿DNA (cffDNA) 以来，其为非侵入性产前检查 (NIPT) 开辟了新的应用领域。自2011年以来，胎儿双倍体的大规模并行测序 (MPS) 已在60多个国家推出。使用在母体血液中循环的cfDNA的NIPT打开了早期，准确和安全的产前检查的大门,并且已经在临床上使用了8年以上 [2] 。21、18、13、单体性X和其他性别的筛选的加权合并检出率和假阳性率报告为99.2% (0.09%) 、96.3% (0.13%) 、91% (0.13%) 、90.3% (0.23%) 和93% (0.14%) [3] 。
越来越多的研究表明NIPT可以减少不必要的侵入性手术和降低医源性胎儿流失的发生率 [4] 。与常规的生物学和超声波筛选相比, NIPT具有许多附加优点,例如更高的灵敏度和特异性,以及在更早的胎龄中进行NIPT的能力。在中国，对于妊娠晚期血清学筛查结果风险高的患者,恢复NIPT筛查21号染色体三体综合症(T21) ,T18及T13 [5] 。目前，越来越多的孕妇选择NIPT [6、7]。
这种最新的产前筛查方法还有其他用途,包括筛查由小于10Mb的复制变体 (CNV) 引起的全常染色体全域部分缺失・重复疾病 (MMS) 。MMS很少见，但占新生儿生殖器异常的1%至2%,通常给家庭和社会带来沉重负担。最近， NIPT进一步发展和扩展专注于Hu等MMS。[8] 和Liang等 [9] demon-stratedNIPT在一些MMS中表现良好。
然而，临床实践中存在许多问题和挑战，需要进行广泛的验证才能决定。
准确的检测率和假阳性率　本研究的目的是回顾NIPT作为非整倍性和CNV筛查测试在42,910例单怀孕中的有效性。

结果

患者背景

2015年4月至2018年12月，在中国宁波妇女儿童医院共采集了42931份母体血样。其中21例失败,失败率0.05%。因此，本研究共纳入样本42910份。孕期为12+0~26+6,年龄为18~49岁,孕龄较大 (35岁以上) 的女性为10742人。42,910例的临床特征如表1所示。在这42,910个样本中，因血浆中胎儿DNA浓度低而需要重新取样的孕妇有348例，重新取样的比率为0.81% (348/42910) ，所有的重新取样都得到了NIPT结果 (表1) 。

所有怀孕的产前检查结果

在NIPT之前，孕妇进行常规的环管筛查,包括胎儿超声波检查 (包含彩色超声波和3D彩色超声波) 和母体血清生物标志物。超声波检查显示202 (0.47%) 的胎儿结构异常,有5749 (13.4%) 的胎儿NT (NT≥3mm) 增加。孕妇血清生物标志物检测显示，高危怀孕2318例 (5.4%) ,严重高危怀孕15863例 (36.97%) ,有8024例 (18.70%) 怀孕无临床指征 (表1) 。

T 21、T 18、T 13和SCA的NIPT结果

流程图如图1所示。共募集了42931个样本,得到了42910个NIPT结果。

异常结果534例 (1.24%) .。在这534例中，21号染色体三体综合症例中的155例 (T21) ， T18例中的44例， T13例中的33例，性染色体异常 (SCA) 例中的147例，其他染色体非整倍性(T21、T18、T13,不包括性染色体非整倍性)例中的46例，以及CNV例中的109例。
获得核型，并验证了NIPT预测的异常结果.。T21, T18, T13和SCA的总异常结果为379例。在这379例中，有302例进行了产前诊断检查，确认了161例真阳性(T21 103例， T18 17例， T13 4例， SCA 37例)和141例假阳性 (FP) 。此外，评估每个测试的阳性预测值 (PPV) 。在21号染色体三体综合症中， PPV为79.23%，在18号染色体三体综合症中为54.84%，在13号染色体三体综合症中为13.79%，在SCA中为33.04% (表2和图1) 。

CNV和其他染色体非整倍性的NIPT结果

此外，由于该技术是全基因组测序，因此分析了CNV和其他一些染色体的非整倍性。CNV异常的总病例如下。
在109例病例中,20例为真阳性,49例为假阳性,50例未确认。评估每个染色体上的CNV数量和大小。CNV根据长度分为3组:CNV≤Mb、5~10 Mb以内的CNV和超过10 Mb的CNV。还评估了每组的PPV。CNV的总PPV为28.99%。5 Mb以下的CNV的PPV为20.83%， 5~10 Mb以下的CNV为50.00%， 10 Mb以上的CNV为27.27%。其他染色体非整倍性病例共46例，包括3例真阳性、29例假阳性和14例不明病例。其他染色体非整倍性PPV为9.38%。在其他染色体非整倍性中，Chr7的非整倍性是最大的一组。NIPT预测的Chr7的非整倍性都是7三体，但所有确认的患者 (总数为9) 被证实为假阳性 (表3和表4) 。

根据怀孕特性的PPV的差异　根据怀孕特性的NIPT的PPV的差异如表5所示。T21总PPV为79.23%，孕产妇T21胎儿PPV为89.29%，在血清学筛查的高危人群如下

86.67%，血清学筛查组的高危因素为71.74%, NT组增加NIPT的PPV最高,为100%。同样， NT增加组的PPV在SCA胎儿的预测中也是最高的。值得注意的是，在胎儿T18胎儿的PPV中，基于B-超声波的胎儿结构异常、NT组的增加以及血清学筛选的高风险全部为100%,而在胎儿T13以及CNV的预测中,基于B-超声波的血清学筛选组以及胎儿结构异常的高风险的PPV分别最高。

考察

在过去几年中， NIPT广泛用于T21、T18和T13的产前筛查。然而，到目前为止，仍然没有进行大规模的临床试验，重点是亚慢性莫索姆复制突变 (CNV) 的效率,其大小通常小于5Mb [8,9] 。此外，临床表现还存在一些问题[10、11]。因此，我们希望本研究包括42,910例，为这些问题提供数据支援。

在这项研究中，使用阳性预测值 (PPV) 来评估NIPT。T21的PPV为79.23%， T18、T13为54.84%、13.79%、33.04%。此外，还分析了其他染色体非整倍性和CNV的PPV。其他染色体非整倍性的PPV为9.38%， CNV为28.99%。最近的研究表明， T21的PPV范围为65~94%， T18为47~85%， T13为12~62% [12~14] 。属于这个范围。有趣的是， CNV的PPV为28.99%，明显高于T13.。在迄今为止的临床检验研究中,特异性MMS的检测结果存在差异,阳性预测值 (PPV) 仅为低~中度 [9] 。
最近提出了一种更宽松的指南,其允许对年轻女性定期进行MMS筛查,其中全常染色体全域部分缺失比非整倍性更频繁地发生 [15] 。根据这项针对42,000多名孕妇的回顾性研究结果， NIPT显示了适用于中枢神经系统引起的MMS的筛选方法的特征。在本研究中，对于5~10 Mb以内的CNV, PPV是最高的 (50.00%) ,对于5 Mb以下的CNV, PPV是最低的 (20.83%) 。Liang的论文 (参考文献) [9] ， CNVs>10 Mb (32%) 和CNVs<10 Mb (19%) 的PPV也较低，但是有效,表明用于全基因组胎儿CNVs的潜在筛选的检查具有足够的灵敏度和特异性。PPV不仅取决于检测的敏感性和特异性，还取决于疾病的患病率 [16] 。在本研究中，低于10 Mb的CNV的PPV为31% (数据未在表中显示， PPV= (5+6) / [ (5+) ] 。

6)+19+6) ] 远远高于梁光烈的论文。此外，在以前的研究中， CNV的总PPV为9.2% [17] ，本研究的PPV远远高于此。
其他染色体非整倍性的PPV低至9.38%，与Liang的论文中所报告的相同 (参考文献) 。[9] ) .这是因为这些aneu-多倍体不是很多并且其中许多具有高的局部胎盘嵌合体 (CPM) 率。NIPT使用无细胞胎儿DNA进行，并且认为母体循环中细胞-胎儿DNA的主要来源是来自细胞-成营养细胞 [18] 的胎盘细胞的凋亡，其不一定代表胎儿。仅胎盘染色体异常而胎儿染色体异常的情况称为CPM [19] ，其发生率约为1~2% [20] .。NIPT是一种筛查检查。 对于NIPT的预先咨询，所选择的女性应该被充分告知准确性、可靠性、假阳性和假阴性率。咨询后，强烈建议根据目前的NIPT指南通过侵入性产前诊断确认所有阳性发现 [21] 。此外，所有被怀疑患有致病或潜在致病胎儿染色体异常的胎儿携带者都计划接受遗传咨询课程,以讨论怀孕管理的选择。
此外，根据怀孕特性对NIPT的不同PPV进行了进一步的研究,本部分的结果需要更多的临床数据的支持。不同怀孕特性表现出不同的PPV, NIPT的PPV在T21中最高,而在其他非整倍性中则低得多 [22] 。孕产妇的年龄过高 (通常>35岁) 是T21的危险因素。因此，高龄产妇PPV明显高于无临床指征的人群。此外，血清学筛查组的高风险PPV高于严重风险组，这与Yu的论文 [23] 一致。

结论

总而言之,本研究涉及具有不同临床特征的孕妇的大规模前瞻性群体。该数据可能对于证明使用NIPT分析不仅适用于一般的全染色体非整倍性，而且适用于CNV也是重要的。然而，这种最新的方法仍处于CNV的早期阶段。在临床实践中，仍需进行准确的除菌率和假阳性率的临床验证试验。

材料和方法

患者

连续采集了孕妇。2015年4月至2018年12月，笔者来到宁波女子儿童医院进行产前检查。共招募了42,910名女性。在抽血之前，从每个参与者那里获得了签名同意。选择标准为 (1) 12+0~26+6之间的怀孕时间, (2) 单一怀孕,以及 (3) 体重指数 (BMI) <100。排除标准为: (1) 染色体异常或有异常的孕妇; (2) 多胎怀孕; (3) 接受干细胞疗法及移植手术的孕妇; (4) 1年内给予同种血液制剂; (5) 4周内接受免疫疗法。

血清学筛查和超声波检查

结合11周至13周+6的怀孕早期筛选,检测血清学筛选试验:用时间分辨免疫荧光测定法检测AFP,游离bHCG和游离E3的浓度。NT由根据胎儿医学基金会协议 [32] 训练的超声波检查员测量。风险值由生命周期软件 (4.0) 计算:高风险， T 21>1/300, T 18>1/350;中等风险， T 21 1/300至1/1000, T 18 1/350至1/1000;产妇年龄 (AMA) ，产妇年龄≥35岁 [23];和NT≥3 mm被定义为NT [33] 增加。

序列测定

在怀孕周龄为12+0~26+6周的乙基-二胺四乙酸 (EDTA) 管中采集母体末梢血 (5ml) 。抽血后立即在4°C下保存。根据上述描述 (参考文献) ，使用2步离心方案在8小时内分离血浆。[6] ) .根据先前的研究 (参考文献) 进行无细胞DNA提取，文库构建，测序和生物信息学分析。[6] ) .对于不含胎儿的DNA片段进行高通量测序,使用JingXinBioelectronSeq4000系统 (CFDA注册许可NO) 。20153400309) 半导体测序器。将测序铅过滤并与人参照基因组 (hg19) 对齐。结合GC校正和Z评分方法来确定胎儿的常染色体非整倍性。在此, Z得分的绝对值大于3的各染色体用染色体非整倍性或全常染色体全区域部分缺失、重复疾病进行标记。

核型分析和羊膜穿刺术

建议NIPT结果阳性的妇女在羊水中进行核型分析以进一步验证。羊膜穿刺术按常规进行。核型分析依据International System forHu-manCytogenetic Nomenclature Guidelines [34] 进行。

阴性病例的追踪调查

对NIPT阴性病例进行了追踪调查。根据中华人民共和国国家健康委员会 (National Health Committee) 的任务指南，婴儿出生后12周开始进行后续观察。追踪内容应包括受试者的怀孕结果和新生儿的健康状况。新生儿的主要观察包括新生儿是T21、T18或T13患者。我们的跟踪调查始于出生后3个月,并严格遵循本研究的国家指南。在追踪随访期间,父母被告知有先天性缺陷的新生儿应该进一步进行遗传诊断。分析中排除了无法追踪的Pa-tient。

统计分析

使用SPSS 20.0软件进行统计分析。测量数据以平均值±标准偏差 (x) 表示。
±SD) ，计数数据采用率 (%) ，正预测值=正数/全部阳性。

缩写

cfDNA:无细胞DNA;CMA:染色体微阵列分析;CNV:拷贝数变异;MMS:全常染色体部分缺失/重复疾病;NIPT:无创产前检查;NT:项部半透明;PPV:阳性预测值

致谢

无法使用。

作者的贡献

所有作者都参与了这项研究和手稿制作。YC, QY和XM收集所有临床数据并进行所有分子遗传学分析。WL参与了数据分析并撰写了手稿。MH参与分子遗传学分析。WL设计了这项研究，草拟并修订了初稿。所有作者都认可了最终的文章。

资金筹集

瑞江保健科技计划 (编号2018 KY 720)

数据和资料的可获得性

根据合理要求，当前研究中使用和/或分析的数据集可从作者处获得。

伦理认可和参与同意

该研究得到了宁波妇女儿童医院伦理委员会的批准。

同意公布

作者声明他们没有任何利益冲突，并表示病例报告中的患者同意报告。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

作者详细信息

宁波女子医院339号，中国，宁波315010号，海州宁波，开通街1号，宁波妇女儿童医院，柳亭街，中国，宁波315010号。2 CapitalBio Technology,中国，北京101111 3北京投资生物医学实验室，北京101111,中国。

受理:2019年6月30日受理:2019年11月15日

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出版商注释

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