希少な常染色体異常やアンバランスな構造染色体異常に対するゲノムワイド非侵襲的出生前検査の利用についての報告

Pascale Kleinfinger^1,* , Laurence Lohmann¹, Armelle Luscan¹, Detlef Trost¹, Laurent Bidat², Véronique Debarge³, Vanina Castaigne⁴, Marie-Victoire Senat^5,6, Marie-Pierre Brechard⁷, Lucie Guilbaud⁸, Gwenaël Le Guyader⁹, Véronique Satre^10,11, Hélène Laurichesse Delmas¹², Hakima Lallaoui¹³, Marie-Christine Manca-Pellissier¹⁴, Aicha Boughalem¹, ylene Valduga¹, Farah Hodeib¹, Alexandra Benachi^5,15 and Jean Marc Costa¹

1. ラボラトリア CERBA, 7/11 Rue de l’Equerre, 95310 Saint-Ouen-l’Aumone, France;
2. llohmann@lab-cerba.com (L.L.); armelle.luscan@lab-cerba.com (A.L.); dtrost@lab-cerba.com (D.T.); Aicha.Boughalem@lab-cerba.com (A.B.); Mylene.Valduga@lab-cerba.com (M.V.); Farah.Hodeib@lab-cerba.com (F.H.); jmcosta@lab-cerba.com (J.M.C.)
3. 婦人科オブステトリック、フランス・デュボス中央病院、フランス・デル・デル・オブ・フランス、95300ポントイズ、フランス・lbidat@wanadoo.fr 婦人科・オブステトリック、CHU リレ、2アブオスカーラブレット、59000リレ、フランス、veronique.debarge@chru-lille.fr フランス・クレテイル市内(第四十条、第九百四十〇条)及びVanina.Castaigne@chicreteil.fr パリ大学医学部、63 Rue Gabriel Peri, 94270 Le Kremlin-Bicetre, France; marie-victoire.senat@aphp.fr (M.-V.S.); alexandra.benachi@aphp.fr (A.B.) 婦人科-Obstetrique, Hopital Bicetre, 78 Rue du General Leclerc, 94270 Le Kremlin-Bicetre, France
4. 細胞遺伝学、聖ジョセフ病院、ブールバード・ド・ルーヴァン、13008 マルセイユ、フランス、26歳、mbrechard@hopital-saint-joseph.fr
5. メデシン胎児サービス、ホータルマンドトルソー、APHPソルボンヌ大学トロソー、フランス、パリ、75012パリ、ドクターアーノルドネットター、26街、lucie.guilbaud@gmail.com
6. ジェネティックメディケル、CHU de Poitiers, 2 rue de la Miletrie, CEDEX, CS 90577, 86021 Poitiers, France; gwenael.leguyader@chu-poitiers.fr
7. 遺伝的染色体、CHU Grenoble Alpes, Avenue Maquis du Gresivaudan, 38700 La Tronche, France; vsatre@chu-grenoble.fr
8. INSERM U1209, CNRS UMR 5309, Institute for Advanced Biosciences, Team Genetics Epigenetics and Therapies of Infertility, Univ. フランス、38700ラ・トロンシュ、グレノブル・アルペス、アベニュー・マキス・ド・グレシバウダン、グレノブル・アルペス
9. 産婦人科・産婦人科医、CHU Clermont Ferrand, and Place Lucie et Raymond Aubrac, 63003 Clermont Ferrand, France; helaurichesse@chu-clermontferrand.fr
10. Cylab, 6 Rue des sports BP 60348, CEDEX 1, 17001 La Rochelle, France; hlallaoui@cylab.fr
11. 出生前診断センター、Timone病院、264 Rue Saint-Pierre, 13005 Marseille, France; manca-pellissier@ap-hm.fr
12. 婦人科-Obstetrique, Hopital Antoine Beclere, AP-HP, 157 Rue de la Porte de Trivaux, 92140 Clamart, France

* Correspondence: PKleinfnger@lab-cerba.com; Tel.: +33-1-34-40-20-78

Received: 8 July 2020; Accepted: 28 July 2020; Published: 1 August 2020

要約:

非定型胎児染色体異常は、以前に認識されていたよりも頻度が高く、直腸胎児の発達が可能である。 これらの非定型染色体異常(ACA)を検出するためのゲノムワイド非侵襲性出生前検査(NIPT)のためのスクリーニング戦略を提案した。 2つのサンプルコホートを検査した。 分析性能は、ACAを用いた192のバイオバンク化血漿サンプル、ACAを用いた42および用いない150からなるコホートAを用いて測定した。 追加の侵襲的診断手技の割合は、ルーチンのNIPTに紹介された妊婦3097人からなるコホートBを用いて決定した。 コホートAの192のサンプルのうち、4つの最初の検査失敗と6つの不一致コールがあり、全体的な感度は88.1%(37/42; CI 75.00～94.81)、特異度は99.3%(145/146; CI 96.22～99.88)であった。 コホートBでは、90件のfrst-pass failure(2.9%)が認められた。 有意な不均衡な染色体異常およびトリソミー8、9、12、14、15、16、および22に限定した場合、異常を示す陽性結果の割合は、1.2%(36/3007)および0.57%(17/3007)であった。 これらの結果は、ゲノムワイドNIPTが、許容可能な感度および侵襲的検査のわずかな増加で、特に母体血清スクリーニング後にリスクが増加し、スクリーニングを構造的異常および最も臨床的に意味のあるトリソミーに限定することにより、ACAのスクリーニングが可能であることを示す。

キーワード:

非侵襲的出生前検査;ゲノムワイドスクリーニング戦略;非定型染色体異常;まれな常染色体異数性;構造的不均衡異常;欠失;重複;感度;特異度;陽性的中率; VeriSeq™ NIPT Solution v2

1. はじめに

いくつかのテストは、染色体異常のスクリーニングに利用可能です。最も一般的なのは、第1期または第2期の伝統的な母体血清スクリーニング（MSS）であり、これは通常、一般的な胎児の異数体異常（トリソミー21、18、13）をスクリーニングし、さらなる検査が必要かどうかを判断するためのリスクスコアを提供するものである。非定型染色体異常（ACA）、すなわちまれな常染色体異数体異常（RAA）や構造的不均衡異常（SUA）のリスクは、MSSのリスクスコアに応じて増加することが示されています[1-3]。妊娠11週から13週の間に測定された経尿道半透明度を含む超音波検査では、いくつかの染色体異常を検出することができます。最近では、非侵襲的出生前検査（NIPT）が利用できるようになった。NIPTは、母体の血漿サンプル中の十分な胎児分画（FF）を確保するために、一般的に妊娠10週以降の妊娠のどの段階でも実施することができます[4]。NIPTは通常、一般的なトリソミーのスクリーニングに使用されます。ACAのためのゲノムワイドスクリーニングは、全ゲノムシークエンシング（WGS）と解析を使用したNIPTアッセイでも可能です[5,6]。胎児の核型やマイクロアレイを行うための絨毛膜絨毛膜サンプリング（CVS）や羊膜穿刺などの侵襲的な処置は診断的と考えられていますが、流産のリスクは小さく[7,8]、膜の早期破裂や絨毛膜羊膜炎のリスクがあるかもしれません[9,10]。

臨床研究では、従来のMSSアプローチよりもNIPTの性能が向上していることが示されています[11]。NIPTアッセイでは、主に大規模並列WGS [12-14]、標的化マイクロアレイハイブリダイゼーション[15]、SNPベースのシーケンシング[16,17]など、いくつかの異なる技術が一般的に使用されています。大規模並列シーケンシング技術は、シングルエンドまたはペアエンドシーケンシングを使用し、ペアエンドシーケンシングではフラグメントサイズと位置の両方を決定できます。NIPTの性能は方法によって異なる場合があり、最近のメタ解析[20]では、NIPTの失敗率は方法によって0.1～6.3%であることが報告されています[21-23]。

近年、検査メニューのオプションには、性染色体異数体 [24,25]、選択的微小欠失/重複 [26,27]、およびACA [5,6,28]が含まれるようになりました。ACAの方が稀ではあるが、NIPT研究では、SUAでは0.1％、RAAでは0.34％のスクリーン陽性率が示されている[29]。Fiorentinoらによる2017年の研究[5]では、妊婦の大規模コホートにおけるゲノムワイド無細胞DNA解析により、高い特異性を維持しつつ、従来のNIPTでは検出できなかった臨床的に関連性のある不均衡が同定された。Pesciaらの研究[30]では、ゲノムワイドなNIPTスクリーニングの使用が胎児の異常の検出の増加につながり、このスクリーニングで同定されたまれな常染色体トリソミーとCNVが胎児の病理の重要な原因であることも明らかにしました。フランスでは、これらのACAはすべての出生前不均衡染色体異常の12.25％、およびすべての出生前核型の2.5％を占めている[31]。これらのACAは、流産、子宮内胎児死亡、知的発達障害、奇形症候群などの予後不良と関連していることが示されている[29,32-35]。

フランスでは、NIPTはトリソミー21スクリーニングのみに償還されます。NIPTは、MSSリスクスコアが1/51～1/1000の間のMSSに続く第2層のスクリーニングとして、また、多胎妊娠の女性、以前にトリソミー21の影響を受けた妊娠の既往歴のある女性、またはどちらかの親が21番染色体に関与するロバートソン転座のキャリアであることが知られている女性のための第1層のスクリーニングとして実施されます。超音波検査で異常が認められる場合や、MSSリスクスコアが1/50を超える場合には、診断検査が推奨されます。

この研究の目的は、(1) ACAの検出のためのVeriSeq™ NIPT Solution v2アッセイによるゲノムワイド無細胞DNA分析の性能を決定すること、および(2) ACAのゲノムワイドNIPTスクリーニングの戦略を決定することでした。私たちの研究では、このゲノムワイドNIPTアッセイは、まれな常染色体異数体および7 Mb以上のセグメント異数体の検出に高い精度を示し、追加の確認的侵襲検査の増加を最小限に抑えられることがわかりました。我々はまた、ゲノムワイドスクリーニングを最も重要な染色体トリソミーおよびSUAに限定し、母体血清スクリーニング後にリスクの高い女性にも提供するという戦略も提案している。

2. 実験部

この研究には、2つの研究コホートが含まれています。コホートAは、ゲノムワイドNIPTアッセイの感度と特異度を決定するために収集された血漿サンプルのバイオバンクで構成された。異常サンプルは、侵襲的手術を受けた患者で、核型またはマイクロアレイ（CMA）により、一般的なトリソミー（トリソミー21、18、13）または性染色体異数性以外の異常が明らかになった患者から、2014年から2019年の間に収集された（補足表S1）。染色体型/マイクロアレイに異常のあるすべての患者は、異常の種類、侵襲的処置の適応、または妊娠年齢に基づく選択をせずに研究への参加を申し出た。このグループは、私たちの細胞遺伝学的検査室で遭遇する染色体異常の中から選択されていないグループを表しています。コホートAの対照NIPTサンプルは、2019年4月から7月に収集された最初の非選択148サンプルで、共通トリソミーまたは性染色体異数性以外の異常のない核型/マイクロアレイ結果を有するもので構成されていた。NIPTサンプルは、侵襲手術と同時に採取した。羊水の核型が正常で、胎盤（絨毛芽細胞）に限局したモザイク症と診断されたため、核型の結果の後に2つの補足的なNIPTサンプルが採取された。

コホートBは、さらに「紹介者集団」と呼ばれ、ゲノムワイドNIPTの使用後に追加の侵襲的診断処置を行う可能性のある割合を決定することを目的として収集されました。これは、臨床検査の一環として一般的なトリソミーに対するルーチンのNIPTを受けている患者からの非選択サンプルで構成されています。ゲノムワイドNIPT解析はその後、この研究のために実施されました。患者は非介入研究のみに同意したため、ゲノムワイド解析の結果は報告されず、胎児の核型と臨床転帰に関する更なるフォローアップ情報を得るために患者に連絡することはありませんでした。これらのサンプルは、2019年3月から8月の間に収集した。両コホートのすべてのサンプルは単胎妊娠のものであった。

コホートAについては、標準的な技術を用いて核型決定を行った：in situ培養（Amniomax®）またはトリプシン培養（羊水の場合はAmniomedium 2®、trophoblastic培養の場合はAmniomax®）、低張性ショック（Hanks®およびMgCl2）、酢酸/メタノールによる固定、およびRHGバンディング。2つの培養物の少なくとも15個のメタフェースを分析した。マイクロアレイは、ゲノムワイドアレイCytoscan® 750K（SNP Affymetrix、750Kマーカー）を用いて、Affymetrixのプロトコルに従って実施した。

すべてのサンプルを、CE-IVDマーク付きVeriSeq™ NIPT Solution v2アッセイ（Illumina, Inc. このアッセイは、ゲノム全体の異常を検出するために、PCRフリーのペアエンドWGSアプローチを使用する。手短に言うと、バイオバンクと紹介者集団の両方からの血漿サンプルを凍結した後、血漿を解凍し、無細胞（cf）DNA抽出ステップを行った。精製されたcfDNA断片は、VeriSeq™ NIPT Microlab STARシステム（スイス、ハミルトン）を使用して自動化されたライブラリー調製を行い、その後、定量とライブラリーのプールを行った。プールされたライブラリは、NextSeq 550Dxシーケンサー（イルミナ社）で配列決定された。バイオバンク化されたサンプルは、紹介者集団のサンプルに使用されたのと同じフローセル上で試験され、フローセルあたり最大4つのバイオバンクサンプルが使用されました。バイオインフォマティクス解析は、VeriSeq™ NIPT Solution v2システムサーバーを使用して実施し、サンプルは、RAAまたはSUAs≧7 Mbの存在について、異常検出または異常検出されなかったものとして分類した。アッセイソフトウェアは、コールを行うことができるかどうかを決定するために胎児分画とカバレッジ情報の両方を考慮に入れ、低胎児分画での正確なコールを可能にする、個別化胎児アヌプリシティ信頼性試験（iFACT）として知られている動的なしきい値メトリックを使用しています。

異なる患者集団間の胎児分画と妊娠年齢の比較は t 検定を用いて行った；<0.05 の p 値は有意であると考えられた。二項95%信頼区間(CI)は性能推定値のために計算された。

本研究は、”人の保護委員会（N◦ PP 14-007）”によって承認されました。女性は、自分のサンプルが研究に使用される可能性があること、およびこの研究の結果が伝達されないことについて、書面による同意を得た。

3.結果

バイオバンクのサンプルであるコホートAは、合計192個のサンプルで構成されていた（図1）。42例の妊娠において、侵襲的検査でRAAまたはSUA≧7 Mbが検出された（補足表S1）：4例のRAA（胎盤に限局した3例のトリソミー16（III型、すなわち、細胞栄養細胞と間葉系の両方で検出された）と1例の非モザイクトリソミー22例。胎盤に限局した3つのトリソミー16（すなわち、細胞栄養細胞と間葉系の両方に認められるIII型）と1つの非モザイクトリソミー22）、32のSUA（重複、欠失、転座誘導染色体）、5つのマーカー（3つのi(12)(p10)、1つのi(18)(p10)、および1つの病理学的誘導染色体15）、および1つのChromoanagenesis（1つまたは複数の染色体座における多数の複雑な再配列）[36]であった。 13人がCMAと核型検査で診断され、2人がCMAのみで診断され、27人が核型検査のみで診断された。19人の患者は羊水（AF）に基づいて診断され、18人はCVSに基づいて診断され、5人は診断に利用できる2つ以上の組織型を持っていた。他の148検体は影響なし（すなわち、RAAまたはSUA≧7 Mb）と分類され、39検体はマイクロアレイ、109検体は核型を有していた。残りの2検体は、異常な細胞芽細胞と正常な胎児の胎盤不一致が認められた。平均妊娠年齢は17.7週（11.0～36.3週）であった。

サンプルはサンプルの制約により1回しか実施できなかったため、失敗率は2.08%であった。失敗した4つのサンプルは、すべて胎児の細胞遺伝学的結果が正常であった妊娠中のものでした。188例のうち、150例が低リスクで、38例が高リスクのNIPTコールであった。平均FFは11.76％であった。バイオバンク集団における正常サンプルと異常サンプルの間に統計的差はなかった（p = 0.52）。

偽陽性コールは1件、偽陰性コールは5件であった。RAAおよびSUAs≧7 Mbの検出に対する感度は88.1％（37/42；CI 75.00～94.81）、特異度は99.32％（145/146；CI 96.22～99.88）であった。1つの偽陽性コールは、限局性胎盤モザイク症1型（CPM1、すなわち細胞栄養細胞のみ）によるものであることが判明した。このサンプルは、NIPTによりdup(11)(p11.12q25); + 13として報告された。細胞栄養細胞の直接解析のカリオタイプは47,XY,+der(13)t(11;13)(q12;q34),t(11;13)であったが、間葉系の長期培養のカリオタイプは46,XY,t(11;13)(q12;q34)であった。

5つの偽陰性の結果の概要を表1に示す；これらのサンプルのFFは3〜15％であった。サンプル1の再配列は、バンド4p16.3の一部が欠失したものであり、その大きさはアレイでは調べられなかった。それは、550 RHGバンディングカリオタイプ（分解能5-10Mb）上で目に見えたが、欠失のサイズは、このNIPTアッセイで検出するための最小サイズのしきい値以下であるため、偽陰性のNIPT結果の1つの可能性のある説明である5から7Mbの間である可能性があります。サンプル2では、偽陰性の結果は、Pallister-Killian症候群で通常見られるように、アイソクロモゾーム12p（OMIM 601803）に起因するモザイク性の疑いの存在に起因しています。サンプル3については、染色体合成が偽陰性結果の最も可能性の高い理由です。サンプル4の偽陰性の生物学的説明はできませんでしたが、FFが低いために不一致を説明できるかもしれません。サンプル5については、FFの低さとモザイクの可能性（染色体がポスト接合体として記述されている）の組み合わせが偽陰性を説明している可能性がある。

表1. コホートAの偽陰性検体の概要

サンプル	胎児の割合	核型	サイズ(Mb)	コメント
1	10%	46,XX,del(4)(p16.3).ish del(4)(WHS-,D4S3359-)	核型に基づく5-8	可能なサイズ<7 Mb
2	15%	arr[GRCh37] 12p13.33q11(173786_37876500)x3	37.7	疑われるモザイク現象
3	9%	46,XX,der(8)?add(8)(p?)?dup(8)(q22q23)dn.ish der(8)(qter->?::?->qter)(D8S504, VIJyRM2053+,wcp8+,VIJyRM2053+).arr[GRCh38] 8p23.3p23.1(158048_6935930)x1,8p23.1p11.23(12585435_ 38267493)x3, 8p11.22(38314367_39246760)x3, 8p11.22(39247087_39386852)x1,8p11.22(39389765_40264413)x3, 8q22.3q23.2(104688373_111952230)x3, 8q24.3(144972747_146295771)x3	全欠失=6.9 重複合計=36.2	クロモナシンセシス
4	3%	46,XX,add(4)(qter).ish add(4)(wcp4-).arr[GRCh37] 5q31.2q35.3(138522878_180715096)x3	41.2
5	4%	46,XY,i(18)(q10)

マイクロアレイの結果(15回の再配列)を有するサンプルでは、NIPTによって検出された部分的不均衡再配列のセグメントサイズとマイクロアレイによって検出された部分的不均衡再配列のセグメントサイズとの間に良好な相関が観察されたが、1例は例外であった(表2のサンプル5)。 NIPTはこのサンプルトリソミー11と呼び、一方、核型およびアレイは転座t(11;12)からの誘導体染色体11を報告し、染色体11の部分末端欠失は2.7 Mb、12トリソミーの部分末端重複は11.7 Mbであった。

表2. アレイとNIPT間のCNVサイズ(Mb)の相関。

サンプル	NIPT	配列
1	18.2	12.8
2	9.7	9.8
3	11.5	11.1
4	28.8	29.9
5	11トリソミー	2.7
6	8.1	6.7
7	10.7	11.5
8	11.3	17.4
9	26	26.6
10	17.2	7.9
11	18.3	18.3
12	9	8.8
13	12.5	12.5
14	13.7	11.8
15	60.1	59.9
CNV、コピー数の変動; NIPT、非侵襲的出生前検査。

部分的に不均衡な再編成を有する35胎児における41個の欠失/重複セグメント≧7 Mbの分析は、検出率が欠失および重複に対して同等であることを示唆している。 対照的に、末端転位と比較して間質転位の感度が高い可能性があり(表3)、この傾向を確認するためには、より大きなサンプルサイズが必要である。

表3. 試験サンプルで観察された不均衡な構造再配列。

転位の種類	核型nで観察	NIPT, nにより検出	検出率、%(95%信頼区間)
削除	13	11	84.6 (54.6-98.1)
複製	28	24	85.7 (67.3-96.0)
間質性	5	5	100 (47.8-100)
端子	36	28	77.8 (60.9-89.9)
CI、信頼区間

我々はまた、MSSリスクスコアに基づいて、有害転帰のリスクが最も高い患者を選択するスクリーニング戦略を決定したかった。Lindquistら [3] はMSSリスクスコアに基づいて有病率を決定した。これらの有病率値を用いて、我々の研究仕様99.32％、感度88.1％を用いて、MSSリスクスコアの違いによる正の予測値（PPV）を算出した（表4）。理論的なPPVは一般集団とMSSリスクスコア>1/300のグループでは11～64％であった。

表4. ACAの有病率およびMSSリスクスコアに基づくPPV。

測定	一般集団	MSSスコア 1/51-1/1000	MSSスコア >1/1000	MSSスコア 1/51-1/300	MSSスコア >1/300
有病率1	0.10%	0.37%	0.61%	1.01%	1.40%
PPV	11%	32%	44%	56%	64%
1値はLindquistらの研究に基づく。 [3]. PPV、陽性的中率;ACA、非定型染色体異常; MSS、母体血清スクリーニング。

コホートB、すなわち照会集団コホート(図2)は、一般的な異数性についてルーチンのNIPTを受けた女性からの3097点のサンプルから構成されており、これらの88%はMSSリスク≧1/1000のために実施された(表5)。 平均在胎週齢は16.8週(10.1.37.0週)であった。 照会集団(コホートB)は、バイオバンク(コホートA)サンプル(それぞれ16.8週間対17.7週間; p = 0.003)よりも平均在胎期間がわずかに低かった。 バイオバンクコホートの妊娠年齢は11.0～36.3週であった。 コホートAとコホートBの胎児分画を比較したところ(表6)、有意差が認められた(p < 0.001)。

表5. 紹介者集団に対するNIPTの適応。

母集団タイプ	失敗	異常なし	一般的なトリソミー	ACAs	合計、n(%)
MSS≧1/1000	71	2596	35	29	2731(88)
MSS < 1/1000	9	139	0	1	149(5)
親のロバートソン転座	0	2	0	0	2 (0)
胎児トリソミーの既往歴	2	51	0	1	54 (2)
一次審査	8	147	1	5	161 (5)
合計	90	2935	36	36	3097
ACA、非定型染色体異常; MSS、母体血清スクリーニング。

表6. バイオバンクおよび紹介者集団の胎児分画。

測定	バイオバンクサンプル(コホートA)(n = 189)	コホートA(n = 147)由来の正常バイオバンクサンプル	コホートAからのバイオバンクサンプルの異常(n = 42)	照会サンプル(コホートB)(n = 3007)
平均	12.27%	12.40%	11.76%	11%
中央値	11%	11%	10.5%	10%
範囲	3-35%	4-35%	3-24%	2-35%

3097点のサンプル(コホートB)のNIPT分析は、90点(2.9%)の初回失敗をもたらした;最終失敗率は、サンプルが2回目の合格試験を受けなかったため不明である。 結果を受け取った3007検体のうち(図2)、36検体(1.2%)がトリソミー13、18、21の陽性結果を示し、36検体(1.2%)がACA陽性結果を示した。 高リスク集団(MSSリスク≧1/1000)では、1.09%がACA陽性であり、一次スクリーニング集団では3.27%が陽性であった(表7)。 36のACAは、10のSUA、25のRAT、および複数の異常を有する1症例から構成された。 すなわち、(1)欠失、重複、転座誘導体染色体、逆位またはマーカー染色体の組換え体、および(2)トリソミー8、9、および22などの古典的染色体再構成に対応するSUA;片親性ダイソミーのリスクのためのトリソミー14および15;妊娠転帰不良のリスクのためのトリソミー16;および同染色体12pのリスクのためのトリソミー12(Pallister.Killian症候群);17検体のみが陽性であった:全研究群ではわずか0.57%、MSSリスク≧1/1000の高リスク集団では0.53%、および第一層NIPTスクリーニングを受けた集団では0.65%(表7)。

表7. NIPTの適応に従った紹介者集団におけるACAs

母集団タイプ	障害を除く合計	グループ1+SUA	グループ2	グループ3	全ACAの有病率	グループ1+SUAの有病率
MSS≧1/1000	2660	14	10	5	1.09%	0.53%
MSS < 1/1000	140	1	0	0	0.71%	0.71%
一次審査	153	1	3	1	3.27%	0.65%
胎児トリソミーまたは親のロバートソン転座の既往歴	54	1	0	0	1.85%	1.85%

ACAs、非定型染色体異常; MSS、母体血清スクリーニング。 第1群には以下のトリソミーが含まれる:これらのトリソミーはしばしば胎児を巻き込むため、トリソミー8、9、および22。片親性ダイソミーのリスクのため、トリソミー14および15;複数の有害な妊娠転帰のリスクのため、トリソミー16;および同種染色体12pがPallister.Killian症候群を引き起こすため、トリソミー12。 グループ2にはトリソミー3および7が含まれており、これらはしばしば栄養膜細胞と関連していることが知られている[37]。 グループ3は、モザイクトリソミー20のような胎児に対して非病原性であるか、または一般に胎盤に付着しているトリソミーを含む他のすべてのRAA(トリソミー1、2、4、5、6、10、11、17、19、および20)を含む。

4. 考察

本稿では、非定型染色体異常の存在を検出するためのゲノムワイドNIPTアッセイの能力を評価した。 NIPTはそれらの検出に対して高度に特異的であることが見出され、CPMは単一の偽陽性呼び出しに対する生物学的説明として確証された。 ゲノムワイドNIPTスクリーニングは、88.1%(CI 75.00.94.81)の感度でバイオバンク集団における不均衡な再配列の大部分を検出し、検出されたCNVサイズについてアレイと良好な相関を示した。 一般的なトリソミー[38]で観察された感度よりも低かったが、偽陰性結果のうち3つ(欠失の大きさ、モザイク現象の疑い、および色素鼻咽頭症)については生物学的説明が疑われた。 特異度が高いため、ACAの存在に対して陽性結果を受けた紹介者集団のサンプル数は少なかった(1.2%)。 臨床現場での失敗率は、最初のサンプルが失敗した場合に追加の血漿サンプルを実行する能力があるため、この研究で観察されたものよりも低いと予想される。 試験(バイオバンク)サンプルは紹介集団よりも在胎期間がわずかに長く、予想通り、平均胎児分画がわずかに高かった。 しかしながら、2つの集団間のdi.erenceは臨床的に意味がなく、したがって、研究対象集団におけるパフォーマンスは、一般妊娠集団で観察されるものと類似している可能性が高い。

一般的な胎児異数性のスクリーニングの価値についてはコンセンサスが得られているが、非典型的な胎児奇形のスクリーニングの有用性については依然として激しい議論があり[39]、臨床コミュニティでは議論の余地が残されている[40]。 これらのACAの予後不良および診断の有用性が関連すると考えられる場合であっても、一般的に、それらはスクリーニング方針の一部となるには稀であると考えられる。 実際、集団におけるこれらの状態の正確な有病率は依然として不明であり、おそらく過小評価されている。なぜなら、選択されていない大規模な妊娠集団では侵襲的検査の普及が広く行われておらず、また、これらの異常についてすべての新生児を日常的に検査する研究もないからである。 フランスの細胞遺伝学研究所の最近の報告[31]では、ACAは出生前の不均衡な染色体異常の12.25%を占めていた。 Lindquistらによると [3]、出生後に発見された可能性のある症例を考慮に入れず、全体的な有病率は1/1000と推定される。 さらに、ACAのリスクはMSSリスクスコア[1.3]に伴って増加することが示されているため、二次検査としての使用はさらに重要である。

我々の研究では、ゲノムワイドなNIPTは、まれなトリソミーやセグメント的不均衡再配列などの非定型胎児異常のスクリーニングの有効な方法であり、不必要な侵襲的処置を大幅に増加させることなく、より多くの胎児異常の検出を可能にする可能性があることを示しています。2 つの戦略は、有害な転帰のリスクが最も高い集団を選択することに貢献する可能性がある。(1)上記の結果のセクションで概説したように、MSSの結果に基づいてリスクが高い妊婦にゲノムワイドなNIPTを推奨すること、および(2)有害転帰のリスクが高いことが知られている限られた数のACAをスクリーニングすることである。2番目の戦略については、一般的な妊娠中の集団では、ゲノムワイドNIPTを用いてACAのスクリーニングを行うことが可能ですが、我々は、MSSリスクスコアが1/1000以上（理論的なPPVは32～64％）の妊婦にゲノムワイドNIPTの実施を制限することを提案しています。フランスでは、染色体再配列の既往歴のない単身妊娠の場合、NIPTはMSSリスクスコアを条件とした第2層スクリーニング検査であるため、この推奨が可能である。ゲノムワイドなNIPTを高リスクのMSSスコアを持つ妊婦に制限することは、ヨーロッパの北欧諸国、ポーランド、ルーマニア、イタリア、オーストラリアなどの他の国でも可能性があります[41]。他の国では、選択されていない集団でゲノムワイドのcfDNA解析を使用することを選択してもよいでしょう。国によってNIPTへのアプローチ方法には大きなばらつきがあり、一部の国では第一段階の選択肢としてNIPTを推奨し、他の国では偶発モデルの一部としてNIPTを推奨しています。Benachiら[42]は、欧州の医療従事者を対象とした調査結果を報告しており、稀な常染色体トリソミーやコピー数変動のスクリーニングなど、NIPTの選択肢を拡大することに関して、各国の医療従事者の間で大きな違いがあることを強調しています。国レベルでのNIPTの償還は、出生前スクリーニングの貴重な一部となるでしょうが、現在のところ、NIPTに資金を提供する国または地域の償還プログラムを持つ国など、特定の国でのみ可能であることにも注意が必要です。他の国では、患者がNIPTの費用を支払う必要がある場合があります、またはそれは患者の健康保険でカバーされている場合があります。

第2の戦略については、まれな常染色体異数体を3つのグループに分類することができる。グループ1は、胎児に最も多く関与するトリソミー8、9、22、トリソミー14、15は一親不和のリスクがあるため、トリソミー16は複数の有害な妊娠転帰のリスクがあるため、トリソミー12はアイソクロモゾーム12pがPallister-Killian症候群を引き起こすため、トリソミー12を含むトリソミーである。グループ2には、細胞栄養細胞に最も頻繁に結合することが知られているトリソミー、すなわちトリソミー3と7が含まれている[37]。グループ3は、モザイク型トリソミー20のような胎児にとって非病原性のトリソミー、または一般的に胎盤に結合しているトリソミーを含む、他のすべてのRAAで構成されている。スクリーニング検査は一定の有病率の異常を検出しなければならないので、グループ1のみのRAAのスクリーニングにはゲノムワイドNIPTを使用することを推奨します。我々のコホートでは、数が少なすぎて決定的な結論を出すことができなかったとしても、5つの異常のうち4つがグループ2と3に属していたので、この戦略は低リスク集団（第1層スクリーニング）では特に興味深いものである。オランダのNIPTコンソーシアム[28]の最近の研究で発表されたコホートを再分析すると、101例ではなく47例の女性だけがRAAsのNIPT陽性コールを受けており、胎児のRAAsを有するすべての症例が診断されていたであろう。我々の研究では、SUAとトリソミー8、9、12、14、15、16、22のみをターゲットにすると、0.57％（17/3007）の陽性NIPTコール率が得られました。

ゲノムワイドNIPTの感度は、特にマイクロ欠失/重複が頻繁に関与しているという事実を考えると、超音波異常のある胎児をスクリーニングするためにNIPTを推奨するほど高くはありません。したがって、超音波検査で胎児の構造異常が認められた患者には、マイクロアレイ解析による診断的侵襲的検査を行うことを推奨する。

この研究の主な強みの一つは、一般的なトリソミー以外の染色体異常の影響を受けたサンプルを利用できることと、すべてのバイオバンクサンプルの胎児核型が既知であったことである。これにより、真の研究の特異性と感度を決定することができた。我々は99.32％（CI 96.22-99.88）という高い特異度を観察し、NIPTによる偽陽性結果は1件のみで、CPMが原因であると判断されました；CPMはNIPTの臨床的特異度に影響を与える生物学的因子として知られています。日常的な妊娠サンプルの紹介集団を利用できることも強みでした。この母集団とセット戦略を使用して、全ゲノムNIPTの使用は、ゲノムワイドNIPTスクリーニングに対する典型的な議論である不必要な侵襲的診断手順の大幅な増加をもたらさないことを示すことができました。ここでは、ACAの存在に対するNIPT陽性コール率は1.2%を超えておらず、これは他の研究[33]に匹敵します。さらに、最も有意なACAを選択することにより、陽性コール率を0.57％に低減することができました。

主な研究の限界の1つは、これが選択された妊娠サンプルのセットであったため、より大きな一般的な妊娠集団を真に代表するものではない可能性があるということでした。最近の他の出版物では、少なくとも10,000人以上の患者集団におけるゲノムワイドなNIPTを調べています[5,6,34,43]が、50,000人以上の患者集団からの結果を報告している出版物もいくつかあります[28,44,45]。しかし、我々の研究集団で観察されたアッセイ不成功率およびFF分布は、紹介先集団で観察されたものと一致しており、データが代表的なものであることを示唆している。本研究のもう一つの限界は、紹介集団の核型および臨床フォローアップ情報がないことであった。紹介集団の目的は、侵襲的手技の潜在的な増加を計算することだけでしたが、このゲノムワイドNIPTアッセイの正負の予測値を決定し、ゲノムワイドNIPTが費用対効果の高いものかどうかを調査するために、その情報を持つことは興味深いことかもしれません。さまざまな妊娠合併症を対象とした大規模な研究により、どのRAAがNIPTでスクリーニングされるべきかについてのさらなる情報が得られる可能性があります。また、ゲノムワイドNIPTが、多胎妊娠の稀な胎児異常の検出に有効な出生前スクリーニングの選択肢になるかどうかを判断するために、さらなる研究が必要です。

5. 結論

結論として、本研究は、ゲノムワイドNIPTアッセイが妊婦におけるACAの存在をスクリーニングするための有効な非侵襲的方法であることを示した。我々は、最も有意な染色体トリソミーとSUAのみをスクリーニングすることを提案する。フランスでは、高リスクのMSSの結果が出た後、正常な超音波検査所見を持つすべての妊婦に対して、ゲノムワイドなNIPTスクリーニングを検討することを提案します。

補足資料

http://www.mdpi.com/2077-0383/9/8/2466/s1, Table S1: コホートAの42の異常検体の概要をオンライン上でご覧いただけます。

著者の貢献:

概念化、P.K.、L.L。およびJ.M.C。; 方法論、P.K.、L.L.、A.B。 （アレクサンドラベナチ）とJ.M.C。; 検証、P.K.、L.L.、A.B。 （アレクサンドラベナチ）とJ.M.C。; 調査、P.K.、L.L.、A.L.、D.T.、L.B.、V.D.、V.C.、M.-V.S.、M.-P.B.、L.G.、G.L.G.、V.S.、H.L.D.、H.L.、M.-C.M.-P.、A.B。 （Aicha Boughalem）、M.V.、F.H.、A.B。 （アレクサンドラベナチ）、およびJ.M.C。; リソース、P.K.、L.L.、A.L.、D.T.、A.B。 （Aicha Boughalem）、M.V。 およびJ.M.C .; 執筆元のドラフトの準備、P.K.、A.B。 （アレクサンドラベナチ）; 執筆、レビュー、編集、P.K.、A.B。 （アレクサンドラベナチ）、およびJ.M.C。; 監督：P.K.、A.B。 （アレクサンドラベナチ）とJ.M.C。; プロジェクト管理、 P.K. およびF.H.すべての著者は、公開された原稿を読み、同意しました。

資金調達:

この研究は外部からの資金を受けていない。

謝辞:

著者らは、Nicole Joye (Hopital Trousseau, Paris)およびElisabeth Simom (Fofation Lenval, Nice) とともに、バイオバンクサンプルの採取に協力してくださったKristine Jinnett (Ilumina, Inc.) に、本稿の作成にご協力いただいたことに感謝する。

利害関係の確認:

著者らは、関心のあることの確認はしないと宣言する。

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