流産調査における無細胞DNAの活用

Emily Colley ^1,2,3,*, Adam J. Devall ^1,2, Helen Williams ^1,4 , Susan Hamilton ³, Paul Smith ^1,2, Neil V. Morgan ⁵ , Siobhan Quenby ^6,7, Arri Coomarasamy ^1,2 and Stephanie Allen ³

1. Tommy’s National Centre for Miscarriage Research, Birmingham Women’s and Children’s Hospital, Birmingham B15 2TG, UK; A.J.Devall@bham.ac.uk (A.J.D.); H.M.Williams.1@bham.ac.uk (H.W.); paul.smith@doctors.org.uk (P.S.); A.Coomarasamy@bham.ac.uk (A.C.)
2. Institute of Metabolism and Systems Research, College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham, Edgbaston, Birmingham B15 2TT, UK
3. West Midlands Regional Genetics Laboratory, Birmingham Women’s and Children’s Hospital, Birmingham B15 2TG, UK; susan.hamilton15@nhs.net (S.H.); stephanie.allen13@nhs.net (S.A.)
4. Institute of Clinical Sciences, College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham, Edgbaston B15 2TT, UK
5. Institute of Cardiovascular Sciences, College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham, Edgbaston, Birmingham B15 2TT, UK; N.V.Morgan@bham.ac.uk
6. Division of Biomedical Sciences, Warwick Medical School, University of Warwick, Coventry CV4 7HL, UK; S.Quenby@warwick.ac.uk
7. Tommy’s National Centre for Miscarriage Research, University Hospitals Coventry & Warwickshire NHS Trust, Coventry CV2 2DX, UK

* Correspondence: emily.colley1@nhs.net

Received: 1 October 2020; Accepted: 22 October 2020; Published: 26 October 2020

概要:

約4回の妊娠に1回は流産し、そのうちの50％は染色体異常が原因です。3回連続して流産した後は、受胎生成物（POC）組織を用いた遺伝学的検査が推奨されています。無細胞DNA（cfDNA）は出生前スクリーニングに利用されてきたが、非妊娠ではほとんど行われていない。我々は、流産における染色体異常を識別するために、母体の血液からの cfDNA の使用を調査した。第 1 期流産を経験した女性の血液サンプル 100,2 例を収集し，保存した．平均妊娠年齢は 7.1 週（範囲：5～11 週）であった．本研究では、POCの遺伝子検査結果のないサンプルは分析しなかった。

CfDNAを抽出し、修正された市販のゲノムワイド非侵襲的出生前検査を用いて分析した。結果は患者には提供されなかった。57 サンプルでは、POC 分析による細胞遺伝学的結果が得られた。染色体異常はPOC解析の47％（27/57）で同定され、cfDNA解析では59％（16/27）が正しく同定された。合計では、75％（43/57）の結果が正しく同定された。平均的な cfDNA 胎児画分は 6%(2-19%)であった。結論として、「胎児率」が十分に高い場合には、cfDNAは流産における染色体異常の検出に使用することができますが、全体的な結果に影響を与える変数を特定するためには、より多くの研究が必要です。

キーワード:

流産；無細胞DNA；細胞遺伝学的分析；染色体異常

1. 序章

妊娠初期の流産は、妊娠中の最も一般的な合併症[1]であり、流産と定義されています。5人に1人の妊娠が自然流産で終わる[2]が、その50％は染色体異常によるものである[3]。染色体異常が妊娠流産の根本的な病因であるかどうかを特定することは、将来の妊娠の予後に影響を与える可能性があるため、重要です。散発性の染色体異常が妊娠喪失の原因である場合、染色体補体が正常である場合よりも、将来の妊娠の予後は良好です。その場合、流産の原因が染色体以外にある可能性があります。染色体再配列のバランスが悪い場合は、両親のどちらかがバランスの取れた染色体再配列を持っている可能性があります。これは、将来の妊娠が同じまたは他の不均衡な染色体再配列の影響を受けやすいことを意味します。このような場合には、再発リスクを評価するために親の核型検査のための血液サンプルを採取することが重要です。

Royal College of Obstetricians and Gynaecologists (RCOG) Green-top Guideline No.17 [4]では、3回目以降の流産後の妊娠組織の細胞遺伝学的分析、または妊娠組織が入手できない場合は親サンプルの核型分析を推奨しています。従来、妊娠組織の異常の検出には、細胞培養やGバンド染色体分析が用いられてきた。しかし、受け取った組織の質が悪いこと、そのような組織から細胞を培養することが困難であること、微小欠失症候群や重複症候群を検出するための分解能が限られていることなどから、しばしば高い失敗率があります。そのため、定量的蛍光PCR（QF-PCR）やマイクロアレイなどの分子ベースのアプローチが研究室を超えて実施されてきた。

現在、流産のための遺伝子検査は、胎盤成分と胎児成分からなる妊娠組織（妊娠生産物（POC）と呼ばれる）を用いて行われている。この組織は、胎児組織を識別し、DNA抽出や細胞培養を行うことができるように、新鮮で、汚染されておらず、固定されていない必要があります。これには、サンプルの誤診につながる可能性のある母体細胞汚染（MCC）のリスクが伴う。POCサンプルは、胎児組織と絡み合った母体組織が含まれています。母体細胞は、ＤＮＡ抽出中に母体ＤＮＡをもたらした胎児組織の選択中に持ち越されたり、細胞培養中に母体細胞が過剰に増殖したりする可能性がある。さらに、多くの場合、ＰＯＣは利用できないか、または患者によって返却されない。

無細胞 DNA (cfDNA) は、Dennis Lo [5] によって初めて同定され、妊婦の血漿中の cfDNA の小片が胎児の全ゲノムを表していることが実証されました。cfDNAはすでに出生前スクリーニングに利用されていますが、現在までのところ、妊娠していない女性を対象とした研究はほとんど行われていません。Clark-Ganheart et al.とYaron et al.による2件の研究 [6,7]のみが、流産の設定でのcfDNAの使用を評価しています。

プロスペクティブコホート研究 Clark-Ganheart ら [6] は、非妊娠の 50 例の cfDNA サンプルを分析しました。超音波検査による妊娠年齢は6.1週から38.4週までの範囲でした。これらのサンプルのうち、50サンプル中38サンプルで報告可能な結果が得られ、そのうち8サンプルではトリソミーが確認されました。Yaronらによる研究[7]では、14週未満での妊娠喪失を分析するためにcfDNAを検査しました。合計で86例の妊娠で、（CVSサンプリングからの）同等のPOCを有するcfDNAの結果が得られました。胎児分画の中央値は5%でした。86サンプルのうち、55サンプル（64％）に染色体異常があり、そのうち30サンプル（55％）は標準的な非侵襲的出生前検査（NIPT）対数尤度比（LLR）カットオフを用いて検出されました。感度を上げるために、50サンプルの「トレーニングセット」を使用して妊娠喪失特異的な閾値を開発しました。これにより、検出率は82％に向上しました。

CfDNAは、簡単な血液検査による流産診断の時点で、流産の染色体原因を確認するために非常に有用である。本研究では、流産における染色体異常の検出にcfDNAをどのように利用できるかを検討し、その結果をPOC検査の結果と比較する。

2. Materials and Methods

2.1. 倫理的承認

この研究はTommy’s National Centre for Miscarriage Researchで行われ、IRASプロジェクトID, 215646で研究倫理承認（REC reference. 16/WM/0423, 23/11/2016, West Midlands-South Birmingham Research Ethics Committee）およびHealth Research Authority（HRA）の承認を受けました。

2.2. 患者サンプル

早期流産を経験し、Birmingham Women’s and Children’s Hospitalが主催するTommy’s National Centre for Miscarriage Researchを受診した患者からインフォームド・コンセントを得た。

NHSトラストとUniversity Hospital Coventry & Warwickshire NHSトラストは、2017年2月から2019年7月までの間に 同意には、患者のPOCと遺伝物質を用いて作業することへの同意が明示的に含まれていた。サンプルは医学研究への寄付として収集され、組織（複数可）はヒト組織法（HTA）に従って取り扱われた。提供者は、更なる使用のために同意を撤回する能力を維持したが、取得後のサンプルに対する 権利は保持しなかった。

資格基準には、１６歳以上の母親の年齢と、妊娠組織が原位置に残っている流産診断時の超音波検査で確認された妊娠期間が１２週未満であることが含まれていました。サンプルは、対応する POC 分析で細胞遺伝学的結果が得られた場合に解析に含まれたが、7 例の既知の 3 倍体症例を除いては除外された。

血液サンプルは cfDNA 分析と βhCG レベルの評価のために採取した。無細胞DNA BCT (STRECK) チューブで cfDNA のために 10 mL までの母体血液を採取し、胎児の妊娠を評価するために、可能であれば超音波で冠-臀部長 (CRL) を測定した。POC検査で得られた染色体異常は、標準的な患者ケアを介して患者に伝えた。CfDNAの結果は患者と共有されなかった。

2.3. 検体の処理

全血から血漿を二重遠心法で分離し、DNA LoBindチューブ（エッペンドルフ）に1 mLのアリコートで移した。これらのアリコートは使用するまで-80℃で保存した。

2.4. 細胞遺伝学的分析

3 回目以降の連続流産後の POC については、RCOG Green-top ガイドライン No.17 [4] に従って、受胎産物（POC）をルーチンの臨床検体として採取し、標的化 QF-PCR と染色体マイクロアレイ解析（CMA）を行った。

まず、POC の DNA に対して QF-PCR によるトリソミースクリーニングを実施し、トリソミー 13、18 または 21、三倍体、性染色体異数性の検査を行った。QF-PCRで異常であれば報告された。正常であれば、OGT CytoSure 8 × 60 k Constitutional v3デザイン、エクソン/遺伝子レベルの分解能は～500 DDD/ClinGenでキュレーションされた発生遺伝子と症候群領域、階層化されたバックボーンの分解能は～120～500 kb、CytoSure v4.9とCBSアルゴリズムを用いたビルドGRCh37での解析を用いて、CMA検査を実施した。マイクロアレイ解析では、1Mbを超えるコピー数の不均衡が検出され、場合によってはより高い分解能が得られた。

2.5. 無細胞DNA検査

外部の検査機関による検査に同意した患者からの血漿（1 mL）をケンブリッジのイルミナ研究所に提出し、以前に説明したように修正したイルミナVeriSeq™ NIPTソリューションv2ワークフローを用いて24サンプルバッチで処理した[8,9]が、最新の分析プラットフォーム[10]を使用し、いくつかの小さな修正を加えた。

3. 結果

流産が確認された後、合計102個のcfDNAサンプルが収集されました。102個のサンプルはすべて、NextSeq500上のVeriSeq™ NIPT v2 Solution分析によって分析された。対応する POC サンプルを 85 個受け取った。合計で 64 例の妊娠で POC 分析による対応する細胞遺伝学的結果が得られ、21 例の POC サンプルは分析に適さず、17 例の cfDNA サンプルは対応する POC サンプルを受信していませんでした。未受領の POC サンプル 17 例と分析に適さない 21 例の POC サンプルは cfDNA 分析から除外され、既知の三倍体妊娠は除外されました（図 1）。

染色体異常は 27/57 例（47%）で POC 分析により確認された。患者のベースラインの特徴を表1にまとめた。対応する細胞遺伝学的解析を行った57例から、平均年齢は34歳（20～43歳）で、臨床妊娠7.1週（5～11週）、胎児率は6％（2～19％）であった。VeriSeq™ を用いて、遺伝的異常16/27（59％）、遺伝的に正常なサンプル27/30（90％）を含むサンプルの合計70％（40/57）が正しく同定された。

これは、サンプルコホートが比較的小さかったものの、感度59％（16/27）、特異度90％（27/30）、精度75％（43/57）に相当する。

表1.分析に適した対応する受胎産物（POC）の結果が得られたcfDNAサンプルの特徴（三倍体妊娠を除く）

	合計 (n = 57)	染色体的に正常 (n = 30)	染色体異常 (n = 27)
母体年齢(年) (平均値と範囲)	34 (20-43)	31 (20-41)	37 (24-43)
過去の損失 (平均値と範囲)	3.8 (0-14)	4.1 (0-14)	3.3 (0-6)
妊娠年齢(週) (平均値と範囲)	7.1 (5-11)	7.4 (5-11)	6.4 (5-9.3)
βhCG (mIU/mL) (平均値と範囲)	38,356 (69-263,766)	50,632 (69-263,766)	21,538 (491-100,638)
胎児の割合(%) (平均値と範囲)	6 (2-19)	7 (2-19)	5 (3-12)

CfDNA解析では、異常16例、正常27例を含む43/57例（75％）が正しく同定された。表2は、POCで異常が検出された症例のPOC結果とcfDNA検査結果を比較したものである。POCで検出された異常は、共通トリソミー（3）、モノソミーX（2）、45、Xと複合した共通トリソミー（1）、モノソミー21（1）、完全レアトリソミー（14）、モザイクレアトリソミー（2）、コピー数変異（4）であった。希少トリソミーの中では、トリソミー22とトリソミー15が最も多かった。胎児分画は3～12％（平均5％）であった。CfDNA の結果は 40/57 サンプルで POC の結果と完全に一致していた。CfDNAの結果は27/30例で正常な結果を生じ、既知の正常例の3/30例で不一致な結果を生じた。2つのモザイクサンプル（サンプルID 51と586）はcfDNA検査では正しく同定されなかったが、これらのサンプルでは他の不均衡が検出された。サンプルID 228ではPOCでモノソミー21の結果が得られましたが、cfDNA検査では他のいくつかの染色体でCNVが同定されました。

4つのサンプルは流産したもので、POC分析で染色体以下の欠失と重複が確認されました（サンプルID 133、202、303、319）。7q22.1q36.3に56Mbの重複と19q13.12q13.43に21Mbの末端重複がcfDNA分析によって検出されました。13q13.3q34に70Mbの欠失、7q36.2q36.3に6Mbの末端欠失、4q34.3q35.2に9Mbの末端重複、5q33.1q35.3に30Mbの末端欠失がcfDNA解析では検出されなかった。

cfDNA解析とPOC細胞遺伝学的解析の間の結果呼び出しを改善できるかどうかを見るために、異なる妊娠、βhCG値および胎児分画カットオフを用いて3つのカテゴリーにグループ化した(表3)。妊娠期間は、7週未満、7～8週、8週以上、妊娠不明の4つのグループに分けた。これらのグループでは、妊娠期間が長くなるにつれて、cfDNA検査で正しく同定された染色体異常が増加した。βhCG値は、8000未満、8000～35000、35000mIU/mL以上の3群に分けた。これらのグループでβhCG値が増加すると、cfDNA検査で正しく同定された染色体異常も増加した。胎児分画群を3群に分けた。5未満、5～8、9以上の3群に分けた。ここでも、胎児分画群の増加に伴い、cfDNA検査による染色体異常の正答率も増加した。

Table 3. POCのCfDNA対核型

		CfDNAの結果
		正常に認識 (%)	認識されない (%)
	合計	43 (75.4)	14 (324.6)
妊娠期間（週）	7週未満	14 (66.7)	7 (33.3)
	7～8週	10 (76.9)	3 (23.1)
	8以上	11 (100.0)	0 (0.0)
	不明	8 (53.3)	7 (46.7)
βhCG (mIU/mL)	8000未満	9 (60.0)	6 (40.0)
	8000～35,000	14 (66.7)	7 (33.3)
	35,000以上	19 (95.0)	1 (5.0)
胎児の割合(%)	5未満	13 (59.1)	9 (40.9)
	5～8	19 (79.2)	5 (20.8)
	9以上	10 (100.0)	0 (0.0)

4. 議論

私たちのcfDNA研究コホートは、バーミンガム女性病院および大学病院コベントリーおよびウォリックシャーにあるTommy’s National Centre for Miscarriage Researchを通じて募集されました。合計102サンプルを改変VeriSeq™ NIPT V2（イルミナ）を用いて評価し、57サンプルを対応するPOC細胞遺伝学的解析で分析した。

cfDNA解析は、3つのカテゴリーに分けて解析した（表3）。胎児分率が低い場合、5%未満の胎児分率では、染色体異常が確認されたサンプルは60%しかなく、そのほとんどが二卵性妊娠のものであった。一方、胎児率が9％以上の場合は、100％の細胞遺伝学的結果が正しく同定されました。我々の研究では、胎児率が5％以上であれば、異常の大部分が検出できることに注目しています。しかし、サンプル数が少なく、生物学的なばらつきがあるため、正確なカットオフを定義することは困難である。

POCの遺伝子検査結果とcfDNA検査の間に観察された不一致は、閉じ込められた胎盤モザイク症が原因である可能性があると考えられます。CfDNA分析では胎盤/細胞芽細胞のみに由来するDNAを検査するのに対し、POC検査では胎児組織と全胎盤組織からなる可能性があります。そのため、結果に不一致が生じる可能性があります。2 つのケースでは、cfDNA 検査では同定できなかったモザイク遺伝子異常が POC 分析で同定された。これらの結果は、トリソーム細胞に限局した胎盤モザイク化によるものか、または現在の方法の限界によるものかもしれません。モザイクはどのような方法でも診断が困難であり、cfDNA解析は生物学的に関連性のある異常な細胞株を検出する上で、現在のPOC検査の補助的な役割を果たすことができる可能性があります。

トミーの流産研究のための国立センターは、再発流産を受けている家族のケアを専門としています。これらの家族は、いつ妊娠するかを非常に意識しており、最初の妊娠期間中に注意深くモニタリングすることで利益を得ています。その結果、私たちの研究コホートの流産は、他の研究よりも早く診断されました。Clark-Ganheartら[6]は16.9週（6.1-37.2）、Yaronら[7]は9.6週（5.1-13.6）を記録している（図2）。

この研究や他の研究では、妊娠組織がまだ原位置にある妊娠喪失例の大部分では、cfDNAを用いて染色体異常を検出することが可能であることが実証されています。この研究では、染色体異常の59％を正しく同定し、POCの結果との一致率は75％でした。これに対して、Clark-Ganheartら[6]は、利用可能な細胞遺伝学的結果がある場合には87.5％の一致率を示し、Yaronら[7]は、妊娠損失特異的LLR閾値を用いた場合には82％の一致率を示した。Yaronら[7]は、50例をトレーニングセットとして使用し、妊娠損失特異的LLR閾値を設定した。全体的な検出率は、非モザイク症例86例で82％であった。これは、トレーニングセットに基づいて妊娠損失特異的なLLRを同定した後に達成されたものである。このことは、このコホートに必要なLLRが単胎妊娠とは異なる必要があることを示している。比較のために、我々の研究では標準的なNIPT LLRカットオフを用いてcfDNAを分析しており、妊娠喪失特異的なLLRを持つことで検出率が向上する可能性があります。この研究の次のステップは、Yaronら[7]が提案したものと同様のアルゴリズムを用いて、このコホートの患者に対してすべての常染色体トリソミーの検出率を最適化するために修正されたLLRを用いたパイプラインを用いた試験を実施することであろう。

この研究や他の研究[6,7]では、cfDNAが流産への遺伝的寄与を評価するために利用できることが示されています。しかし、使用するアッセイに依存して見逃される可能性のある遺伝的異常がまだ存在しています（例：トリプ ロイドやモザイクサンプル、低胎児率/低妊娠時の常染色体トリソミー）。三倍体の症例は、修正されたIllumina VeriSeq™ NIPT solution v2ワークフローでは検出できなかったため、本研究とYaronら[7]の両方で除外された。しかし、cfDNAの解析のための一塩基多型ベースのプラットフォームは、三倍体症例を同定することができるはずである。

cfDNAは、現在の細胞遺伝学的検査を完全に置き換えることはできません。Yaronら[7]は、再発性妊娠喪失におけるcfDNA検査を利用する再発性妊娠喪失アルゴリズムを提案しました。

3回目以降の妊娠喪失が診断された場合、Royal College of Obstetricians and Gynaecologists (RCOG) Green-top Guidelines No.17 [4]による現在のガイドラインでは、妊娠組織に胎児異数性がないかどうかを検査することになっています。このルーチン検査と並行して、母体の血液サンプルを採取してcfDNA検査を完了させることができます。cfDNA検査で異数性が検出され、流産の理由が説明された場合、数値誤差は通常散発的に発生し、その後の妊娠が成功する可能性はマイナスの影響を受けないため、それ以上の作業は必要ありません。cfDNAはアンバランスな染色体異常しか検出しないので、もしcfDNA検査で染色体異常が検出されなかった場合は、cfDNA検査で検出できない染色体異常（CNV、三倍体、モザイクサンプルなど）があるかどうかを確認するために、POCの細胞遺伝学的分析を推奨すべきである。これにより、必要なPOC検査の数を減らすことができ、POCが利用できない多くの患者に対して結果が得られる可能性があります。POCが利用できない場合でも、いくつかの染色体異常は見逃してしまうことに注意することが重要です。不均衡な転座が確認された場合には、両親のどちらか（または両方）がこの転座のキャリアであるかどうかを評価するために、親の核型検査を推奨すべきである。

5. 結論

妊娠喪失の遺伝的結果を知ることは、将来の妊娠の予後を知るために、患者のカウンセリングの際に応用することができます。また、妊娠喪失に伴う罪悪感から解放され、心理的なサポートを提供するのにも役立つかもしれません。

流産の原因が染色体異常によるものかどうかを特定するためにcfDNAを使用することは、検査用の妊娠組織が利用できない、あるいは患者の希望により、従来の細胞遺伝学的検査が利用できない患者に大きな臨床的影響を与えることになるでしょう。しかし、cfDNA検査は流産診断時に妊娠したままの場合にのみ実施可能です。

私たちは、妊娠組織がまだ原位置にあるときに母体血漿サンプルを採取し、十分な胎児分画がある場合には、いくつかのケースでcfDNAを使用して流産の遺伝的異常を検出することができることを実証しました。さらなる作業は、この検査を改善し、それが臨床的に適用できるように、全体の結果に影響を与える可能性のある変数を特定するために必要とされています。

著者の貢献

E.C.–データ解析と執筆; A.J.D.–研究デザインと倫理的承認; H.W.–研究デザイン、倫理的承認、助成金管理と編集; S.H.–データ解析と批判的評価; P.S.–研究デザインと批判的評価; N.V.M.–監修と批判的評価; S.Q.–批判的評価; A.C.–研究デザイン、監修と批判的評価; S.A.–研究デザイン、監修、批判的評価、データ解析、執筆と編集. すべての著者は原稿を読み、公表されたバージョンの原稿に同意した。

資金提供

この研究は、トミーの流産研究のためのトミーの国立センターに資金を提供しているトミーの慈善団体から資金提供を受けています。

謝辞

著者は、Lieve Page-Christians、Philippa Burns、Patrizia Di Pietro、Cosmin Deciu、Sarah Kinnings、Eoin Brown、Victoria Corey、Kathryn Robinson、Sven Schaffer、Sucheta Bhatt、Barbara Baggiani、Matt Smith、Marion Burdin、Jasmin Dehnhardtに感謝します。著者らは、患者の募集とサンプル収集を行ったバーミンガム女性・子供病院のトミー国立流産研究センターと大学病院コヴェントリー＆ウォリックシャーの研究チームに感謝しています。

利益相反

著者は利益相反を宣言していません。

参考文献

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出版者注

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